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多光子显微镜成像技术之三十八 基于SMA深度扫描的双波长多模式多光子显微镜
  2024-02-05      168

文章来源:OFweek 激光网 作者:光波常

多光子显微(Multiphoton Microscopy, MPM)成像是一种非侵入、无标记成像技术。利用来自不同模态的非线性信号,多模态MPM可以提供代表不同组织结构的互补信息。本文研究展示了一种具有深度扫描的多模态MPM系统[1]。

  

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图1 多模式MPM成像系统[1]

实验装置中的激发光源采用中心波长位于1580 nm的锁模掺铒光纤激光器,脉宽约80 fs。作者利用PPLN晶体通过二倍频,获得了中心波长为790 nm的飞秒脉冲,转化效率约为35%。790 nm飞秒脉冲可用于激发TPEF(two-photon excitation fluorescence, TPEF)和SHG(second harmonic generation, SHG)信号,而1580 nm飞秒脉冲可用于激发THG(third harmonic generation,THG)信号。作者采用MEMS反射镜实现XY平面扫描,采用形状记忆合金(shape-memory-alloy, SMA)驱动的物镜实现Z方向的深度分辨扫描,深度扫描范围为~370 μm。图2展示了SMA驱动物镜单元的工程设计和组装,这里的SMA具有低成本、扫描范围大、响应快等优势。

  

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图2 SMA驱动物镜组的构造[1]

与双光子成像相比,三光子非线性效应的效率低得多,因此THG信号在大多数动物组织中尤其微弱,作者通过图像自定义去噪算法来提高图像对比度。图3比较了处理前、ImageJ异常值去除去噪处理后和自定义去噪算法处理后的超低信噪比图像。通过图3可以看出,本文作者采用的算法能够有效增强弱通道的对比度,提高组织结构的可视化。

  

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图3 去噪前后的THG图像[1]

为了证明该多模态MPM的成像与深度扫描能力,作者对各种动物组织样本和植物样本成像。作者通过SMA驱动物镜获取步长为4 µm的图像堆栈,在软组织中的穿透深度为250 µm,骨组织中的穿透深度约为150 µm。由于激发波长不同,双光子和三光子原始图像之间的焦点偏移约为80 µm,在合并通道时需要校正。图4展示了从不同深度的动物组织获得的图像,来自三个通道的互补信息区分了内部的各种结构和物质,可以看到皮肤组织和骨组织上的不同层结构。

  

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图4 来自不同深度动物组织的多模式MPM图像[1]

图5显示了从真菌和植物组织中获得的图像。与具有丰富胶原纤维的动物组织不同,从真菌和植物组织中只能获得非常弱的SHG信号。

  

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图5 来自不同深度的真菌和植物组织样本的多模式MPM图像[1]

在本研究中,作者开发并演示了一种基于掺铒光纤激光器的紧凑型多模态MPM系统,分别为三光子和双光子成像提供1580 nm和790 nm的激发波长,并通过SMA驱动的物镜实现深度分辨扫描。这种具有深度扫描物镜的微型多模态MPM在未来临床的内窥镜设计中显示出巨大的潜力。

参考文献:

[1]Wentao W ,Qihao L ,Christoph B , et al.Dual-wavelength multimodal multiphoton microscope with SMA-based depth scanning.[J].Biomedical optics express,2022,13(5):2754-2771.

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